A rekombináns DNS olyan molekulák, amelyeket laboratóriumi genetikai rekombinációs technikákkal hoznak létre, hogy több forrásból származó genetikai anyagot kombináljanak. Ez azért lehetséges, mert az összes élőlény DNS-molekuláinak azonos a kémiai szerkezete, és csak a benne lévő nukleotidszekvenciában különböznek.
Létrehozás
A molekuláris klónozás egy laboratóriumi eljárás, amelyet rekombináns DNS létrehozására használnak. Ez a két legszélesebb körben alkalmazott módszer egyike, a polimeráz láncreakció (PCR) mellett. Lehetővé teszi a kísérletező által kiválasztott bármely DNS-szekvencia replikációjának szabályozását.
Két alapvető különbség van a rekombináns DNS-módszerek között. Az egyik az, hogy a molekuláris klónozás élő sejtben való replikációt foglal magában, míg a PCR in vitro. Egy másik különbség, hogy az első módszer lehetővé teszi a DNS-szekvenciák kivágását és beillesztését, míg a második módszer a meglévő sorrend másolásával fokozódik.
Vektor DNS
A rekombináns DNS beszerzéséhez klónozó vektor szükséges. Plazmidokból vagy vírusokból származik, és egy viszonylag kis szegmens. A molekuláris klónozáshoz használt vektor kiválasztása a gazdaszervezet megválasztásától, a klónozandó DNS méretétől és attól függ, hogy kell-e kifejezni idegen molekulákat. A szegmensek különféle módszerekkel kombinálhatók, például restrikciós enzim/ligáz klónozással vagy Gibson-összeállítással.
Klónozás
A szabványos protokollokban a klónozás hét lépésből áll.
- Válassza ki a gazdaszervezetet és a klónozó vektort.
- DNS-vektor beszerzése.
- Klónozott DNS képződése.
- Rekombináns DNS létrehozása.
- Bevitele a gazdaszervezetbe.
- Az ezt tartalmazó organizmusok kiválasztása.
- A kívánt DNS-inszertekkel és biológiai tulajdonságokkal rendelkező klónok kiválasztása.
A gazdaszervezetbe történő transzplantáció után a rekombináns konstrukcióban lévő idegen molekulák expresszálódnak vagy nem. Az expresszió megköveteli a gén átstrukturálását, hogy olyan szekvenciákat tartalmazzon, amelyek a DNS-termeléshez szükségesek. A gazdagép fordítógépe használja.
Hogyan működik
A rekombináns DNS akkor működik, ha a gazdasejt rekombináns génekből származó fehérjét expresszál. Az expresszió attól függ, hogy a gént olyan jelekkel veszik körül, amelyek utasításokat adnak a transzkripciójához. Ide tartozik a promoter, a riboszómakötés és a terminátor.
Problémák merülnek fel, ha a génintronokat vagy szignálokat tartalmaz, amelyek terminátorként működnek a bakteriális gazdaszervezet számára. Ez idő előtti felmondáshoz vezet. Előfordulhat, hogy a rekombináns fehérje nem megfelelően dolgozott fel, hajtogatott vagy lebomlott. Termelése eukarióta rendszerekben általában élesztőgombákban és fonalas gombákban történik. Az állatketrecek használata nehézkes, mert sokak számára erős támasztófelületre van szükség.
Az élőlények tulajdonságai
A rekombináns DNS-molekulákat tartalmazó szervezetek látszólag normális fenotípusúak. Megjelenésük, viselkedésük és anyagcseréjük általában nem változik. A rekombináns szekvenciák jelenlétének kimutatásának egyetlen módja, ha magát a DNS-t vizsgáljuk meg polimeráz láncreakció teszttel.
Bizonyos esetekben a rekombináns DNS káros hatással lehet. Ez akkor fordulhat elő, ha az aktív promotert tartalmazó fragmense egy korábban néma gazdasejt gén mellett található.
Használja
A rekombináns DNS-technológiát széles körben használják a biotechnológiában, az orvostudományban és a kutatásban. Fehérjéi és egyéb termékei szinte minden nyugati gyógyszertárban, állatorvosi rendelőben, rendelőben, orvosi vagy biológiai laboratóriumban megtalálhatók.
A legáltalánosabb alkalmazás az alapkutatásban van, ahol a technológia elengedhetetlen a biológiai és orvosbiológiai tudományok mai munkájához. A rekombináns DNS-t a gének azonosítására, feltérképezésére és szekvenciájára, valamint azok meghatározására használjákfunkciókat. Az rDNS-próbákat egyedi sejtekben és teljes organizmusok szöveteiben történő génexpresszió elemzésére használják. A rekombináns fehérjéket laboratóriumi kísérletekben reagensként használják. Néhány konkrét példa alább látható.
Rekombináns kimozin
A kimozin az abomasumban található, a sajtkészítéshez szükséges enzim. Ez volt az első génmódosított élelmiszer-adalékanyag, amelyet az iparban használtak. A mikrobiológiailag előállított, a borjúból származó enzimekkel szerkezetileg azonos rekombináns enzim olcsóbb és nagyobb mennyiségben készül.
Rekombináns humán inzulin
Gyakorlatilag felváltotta az állati eredetű (pl. sertés és szarvasmarha) eredetű inzulint az inzulinfüggő cukorbetegség kezelésére. A rekombináns inzulint úgy állítják elő, hogy a humán inzulin gént Eterichia nemzetségbe tartozó baktériumokba vagy élesztőgombákba juttatják.
Növekedési hormon
Azoknak a betegeknek írják fel, akiknek az agyalapi mirigye nem termel elegendő növekedési hormont a normál fejlődés támogatásához. Mielőtt a rekombináns növekedési hormon elérhető lett volna, a holttestek agyalapi mirigyéből nyerték. Ez a nem biztonságos gyakorlat egyes betegeknél Creutzfeldt-Jakob-kór kialakulásához vezetett.
Rekombináns véralvadási faktor
Ez egy véralvadást elősegítő fehérje, amelyet vérzési rendellenességgel járó hemofíliában szenvedő betegeknek adnak be. Nem képesek termelnifaktort kellő mennyiségben. A rekombináns VIII-as faktor kifejlesztése előtt a fehérjét több donortól származó nagy mennyiségű emberi vér feldolgozásával állították elő. Ez nagyon nagy kockázatot jelentett a fertőző betegségek átadására.
HIV-fertőzés diagnózisa
A HIV-fertőzés diagnosztizálására szolgáló három széles körben használt módszer mindegyikét rekombináns DNS felhasználásával fejlesztették ki. Az antitest teszt a fehérjét használja. Reverz transzkripciós polimeráz láncreakció segítségével észleli a HIV genetikai anyag jelenlétét. A teszt kidolgozását a HIV-genomok molekuláris klónozása és szekvenálása tette lehetővé.
