A PCR vagy polimeráz láncreakció egy kifinomult laboratóriumi technika, amelyet széles körben használnak az orvostudományban és más tudományos területeken. A PCR-diagnosztika egy időben igazi áttörést jelentett a tudományban.
Leírás
A kvantitatív PCR a valós idejű PCR egy fajtája.
Ezen a PCR egy változata értendő, amelyben a reakció kinetikáját folyamatosan rögzítik, ami lehetővé teszi a specifikus DNS nukleotid szekvenciák tartalmának minőségi értékelését egy komplex molekulaelegyben.
A kvantitatív PCR-módszert az alábbiakban részletesebben tárgyaljuk.
Az elemzés lényege
A fertőzések diagnosztizálására különösen gyakran alkalmaznak kulturális és szerológiai módszereket. Az első szerint a vérszérumban lévő fertőző kórokozó elleni antitesteket határozzák meg. A másodikban a beteg embertől vett biológiai anyagot egy meghatározott táptalaj elvetésére használják, amely kedvező a kórokozókolóniák növekedéséhez. Diagnosztika mindkettőbenaz eset napokig vagy hetekig tarthat.
A PCR vizsgálat különböző biológiai anyagokkal is elvégezhető, amelyeket beteg személytől kapnak. A vér és egyéb kóros, fiziológiai és biológiai közegek és folyadékok mintaként működnek. Csinálhat PCR székletet vagy vizeletet.
Az atipikus és vírusos fertőzéseket leggyakrabban kvantitatív PCR-rel diagnosztizálják, mivel előfordulhat, hogy az általuk kiváltott kóros folyamat sajátosságai miatt nem könnyű őket diagnosztizálni. Az ilyen fertőzések meghatározása időbe telik, amely alatt a szervezetben szerológiai módszerekkel meghatározott antitestek képződnek. Ez azonban bizonyos esetekben elfogadhatatlan.
A végrehajtás módja
PCR módszer - fertőzés laboratóriumi kimutatása a betegtől izolált mintákban (in vitro).
A polimeráz láncreakció végrehajtásához speciális reagensekre van szükség.
A vizsgálati anyagot reagensekkel ellátott kémcsövekbe helyezzük. A kémcsöveket egy speciális berendezésbe helyezik - egy PCR-erősítőbe, amelyet a kívánt RNS vagy DNS-fragmensek amplifikálására (számának növelésére) terveztek, a PCR-erősítő ciklikus üzemmódban működik. Bármely ciklusban, ha a minták tartalmazzák a kórokozó RNS- vagy DNS-szekvenciáját, akkor ezen nukleinsavak részecskéinek egyre több másolata halmozódik fel az oldatban. Meghatározhatja a kórokozó jelenlétét és mennyiségét a mintákban.
PCR-típusok
A PCR-rel végzett kvalitatív elemzés lehetővé teszi a következő eredmény elérését:
- negatív, ha a kérdéses kórokozó nem található a mintákban;
- pozitív, ha a mintákban olyan szekvenciák találhatók, amelyek egy adott kórokozóra jellemzőek.
Pozitív PCR-eredmény esetén 95%-os pontossággal beszélhetünk diagnosztizált fertőzés jelenlétéről. Ugyanakkor a diagnosztikai célokra használt PCR-készletek pontossága eléri a 100%-ot.
Általában a hibás eredmények 5%-át az emberi tényező határozza meg. Például a reagensek elemzési és tárolási technikájának megsértése jelentősen csökkentheti a vizsgálat pontosságát.
A kvantitatív PCR meghatározza a vírusterhelés fogalmát. Meg lehet határozni, hogy hány kórokozó DNS-készlet volt a betegtől vett mintákban.
A fertőzés súlyossága egyenesen arányos számuk növekedésével. A vírusterhelés csökkentésére irányuló terápia sikerét is meghatározhatja.
Benyújtás PCR bioanyagra
A kvantitatív PCR-t a klinikán végezzük, főleg reggel. Az orvosnál tett látogatás során a betegnek elmondják, mit kell venni: kaparás, kenet, vizelet vagy vér. A PCR képes kimutatni a kórokozókat az anyag szennyezettségének mértékétől függetlenül.
A pozitív elemzéshez elméletileg csak egy kórokozó jelenléte szükséges a mintákban. A gyakorlatban igyekeznek még kedvezőbb feltételeket teremteni. Ehhez van néhány ajánlás:
- ha lekaparnak vagy kenetet vesznek a nemi szervrőlszervek, tartózkodnia kell az intim közösüléstől három nappal a vizsgálat előtt;
- nem zuhanyozhat le antibakteriális gyógyszerekkel, és nem mosakodhat meg az elemzés előtt;
- három órával a húgycsőkenet vétele előtt türelmesnek kell lenni, és nem szabad kiüríteni a beleket.
Ne tartsa be ezeket a szabályokat véradáskor.
Hogyan értelmezik a kvantitatív PCR-elemzés eredményeit?
A kapott eredmények mennyiségi értékelése
Számos klinikai helyzetben megjelenik a kezelés hatékonyságának és/vagy a patológiai folyamat dinamikájának problémája. Az ilyen kérdések különösen fontosak krónikus fertőzésben (humán immunhiány vírus, hepatitis B és C) szenvedők vizsgálatakor. A diagnosztizálás során azon alapulnak, hogy az amplikonok (PCR-termékek) felhalmozódása arányos a kívánt gén kópiáinak jelenlétével a vizsgált mintában.
Természetesen a kvantitatív PCR eredményeit figyelembe véve gélelektroforézissel történik a speciális PCR jelek intenzitásának vizsgálata. A kapott eredmények helyes kvantitatív értékelésének előfeltétele továbbá a pozitív, megbízható kontrollminták, amelyek a kívánt gén ismert számú kópiáját tartalmazzák (például a hepatitis C gén ezer másolatát egy PCR-reakcióhoz). A kvantitatív kontroll számos sorozathígítása lehetővé teszi kalibrációs görbék létrehozását, és a klinikai minták klinikai genokópiáinak értékelésére használják.
A kvantitatív PCR meghatározásában kulcsfontosságú eredmény a létrehozásafluoreszcens DNS-próbák, amelyeket egyszerű primerekkel egyidejűleg adnak a reakcióelegyhez, és lehetővé teszik a PCR folyamat időbeni nyomon követését, azaz valós idejű PCR-t.
A TaqMan módszertan olyan fluoreszcens DNS-próbák szintézisére vonatkozik, amelyek specifikusak az amplikon középső részére, és két jelöléssel rendelkeznek a végén. Az egyik egy fluoreszcens címke, a második egy kioltó molekula ennek a fluoreszcenciának.
Egy speciális eszköz, amely egy fluoriméter és egy termoblokk-erősítő hibridje, minden kémcsőben folyamatosan méri a fluoreszcenciát (valós idejű PCR-elv). 20-40 PCR-ciklus után minden mintára egyedi görbék készülnek. A kívánt gén kópiáinak száma, amely a tesztmintában található, kiszámítható a kontrollmintákkal végzett kalibrációs görbékből.
A PCR fluoreszcens módszerrel történő megvalósításának fontos jellemzője továbbá, hogy az eredmények figyelembe vételekor nincs szükség PCR-keverékkel ellátott csövek kinyitására. Ez csökkenti a helyiség amplifikációs termékekkel való szennyeződésének lehetőségét, és nincs szükség speciális munkaterületek kijelölésére az elektroforézishez.
Mit mutat a kvantitatív PCR-átirat?
Mit fedeztek fel?
Egy olyan módszerrel, mint például a kvantitatív PCR, minőségi változásokat találnak a génekben: inszerciók, deléciók és pontmutációk. Egyes örökletes rendellenességeknél azonban a megfelelő tünetek bizonyos gének tartalmának megváltozására válaszul jelennek meg.
KöszönömA kvantitatív elemzés numerikus eredményt ad, leggyakrabban NE / ml-ben. Ez azt jelenti, hogy a vizsgált minta egy milliliterében a kórokozó RNS-ének vagy DNS-ének bizonyos számú, nemzetközi mértékegységben mért másolatát találták.
A fertőzés mértékétől függően diagnosztizálják a fertőzés súlyosságát. Általában vérvizsgálatot végeznek a vírusterhelés meghatározására, mivel a vírusok betegség alatt szabadon mozognak a vérben.
Jellemzők
A vérvizsgálat kvantitatív PCR-jének két jellemzője van.
- Az elemzést primerek vagy dezoxiribonukleozid-trifoszfátok jelenlétében végezzük, amelyek fluoreszcens vagy radioaktív jelöléssel vannak ellátva a képződött PCR-termék tartalmának pontos meghatározásához.
- A PCR-folyamatban korán fejezze be a reakciót, mielőtt túl sok PCR-termék jelenne meg. Ez annak a ténynek köszönhető, hogy a telítés végső szakaszában, amikor sok PCR-termék van, mind maga az enzim, mind a szubsztrátok a reakció korlátozó láncaiként működnek. A következő PCR-ciklus végét ilyen körülmények között már nem a PCR-termékek számának megduplázódása jellemzi, a különböző minták közötti jelentéktelen mennyiségi különbségek kiegyenlítődnek, amelyek a reakcióciklus-sorozaton való áthaladás korai szakaszában meglehetősen egyértelműen meghatározottak..
PCR-diagnosztika költsége
A PCR kutatásnak költsége van, ami attól függ, hogy milyen fertőzést fognak vizsgálni, az elemzés módszertanától és a vizsgálati anyagtól függ. Egy fertőzés meghatározásához be kell engednie magát200-800 rubel. A bioanyag felvételének díja is hozzáadódik - körülbelül 400 rubel.
