A kromatográfia az anyagok elválasztásának egyik módszere. A mikrorészecskék fizikai és kémiai tulajdonságainak későbbi minőségi és mennyiségi elemzésére használják. Ennek a technológiának egy változata az affinitáskromatográfia. A fehérjevegyületek molekuláris affinitás tulajdonságának felhasználásával történő megkülönböztetésének ötlete több évtizede ismert a tudományban. Fejlesztését azonban csak az elmúlt években, a mátrixként használt, erősen porózus hidrofil anyagok bevezetése után kapta meg. Ez a módszer lehetővé teszi analitikai (anyagok szétválasztása és azonosítása) és előkészítő (tisztítás, koncentrálás) problémák megoldását is.
Essence
Az affinitáskromatográfia (a latin affinis szóból – „szomszédos”, „rokon”) az affinitási kölcsönhatásokon alapul, amelyek egy távtartó molekula (ligandum vagy affins) és egy célmolekula között nagyon specifikus kötések kialakítását jelentik. Ezek a mechanizmusok a természetben széles körben elterjedtek (mediátorok vagy hormonok és receptorok kapcsolódása, antitestek ill.antigének, polinukleotidok hibridizációja és más típusú folyamatok). Az orvostudományban az affinitáskromatográfiát 1951 óta használják gyakorlati célokra
Az összetevők a következőképpen vannak elválasztva:
- az izolálandó anyagot tartalmazó munkaoldatot engedjük át a szorbensen;
- A szorbens mátrixra lerakódott ligandum megtartja ezt az anyagot;
- koncentrált (felhalmozódás);
- az izolált anyag extrakciója a szorbensből oldószeres mosással.
Ez a módszer lehetővé teszi egész sejtek izolálását. A különbség a hagyományos szorpciós kromatográfiától az, hogy az izolált komponens erős biospecifikus kötődést mutat a szorbenshez, amelyet nagy szelektivitás jellemez.
Adszorbensek
A következő anyagokat használják adszorbensként:
- Agaróz, agarból nyert poliszacharid alapú gélvegyületek. A leggyakrabban használt 3 fajta: Sepharose 4B, CL (cross-linked agarose) és affi-gel. Ez utóbbi készítmény agaróz és poliakrilamid módosított gélje. Nagyobb a biológiai tehetetlensége, nagy a vegyi és hőállósága.
- Szilícium-dioxid (szilikagél).
- Üveg.
- Szerves polimerek.
A ligandumokkal való érintkezés során fellépő mechanikai akadályok kiküszöbölésére további anyagokat használnak a hordozótól való elválasztására (peptidek, diaminok, poliaminok, oligoszacharidok).
Felszerelés
Az affinitáskromatográfiás berendezés a következő fő egységeket tartalmazza:
- tárolótartály a mozgófázishoz (eluens);
- nagynyomású szivattyúk közepes tápellátáshoz (leggyakrabban dugattyús);
- szűrő eluensek portól való tisztítására;
- adagolóeszköz;
- kromatográfiás oszlop a keverék elválasztásához;
- detektor az oszlopból kilépő különálló komponensek észlelésére;
- kromatogramrögzítők és mikroprocesszor-egység (számítógép).
Az oldott levegő mennyiségének csökkentése érdekében először héliumot vezetnek át a mozgófázison. Az eluens koncentrációjának megváltoztatásához több, a programozó által vezérelt szivattyút telepítenek. A kromatográfiás oszlopok rozsdamentes acélból (a korrózióállóság fokozott követelményei miatt), üvegből (univerzális opció) vagy akrilból készülnek. Preparatív célokra átmérőjük 2-70 cm között változhat. Az analitikai kromatográfiában Ø10-150 µm mikrooszlopokat használnak.
A detektorok érzékenységének növelése érdekében reagenseket vezetnek a keverékbe, amelyek hozzájárulnak olyan anyagok képződéséhez, amelyek több sugarat nyelnek el a spektrum ultraibolya vagy látható tartományában.
Módszertan
A folyadékaffinitáskromatográfiának 2 fő típusa van:
- Oszlop, amelyben az oszlopot megtöltik egy állófázissal, és egy keveréket áramoltatnak át rajtaeluens. A szétválás történhet nyomás vagy gravitáció hatására.
- Vékony réteg. Az eluens a lapos adszorbens réteg mentén kapilláris erők hatására mozog. Az adszorbenst üveglapra, kerámia vagy kvarc rúdra, fémfóliára kell felvinni.
A munka fő szakaszai a következők:
- adszorbens előkészítése, ligandum rögzítése a hordozón;
- az elválasztó keverék betáplálása a kromatográfiás oszlopba;
- mobilfázisú betöltés, komponenskötés ligandum által;
- fáziscsere a megkötött anyag izolálására.
Úticél
Affinitáskromatográfiával a következő típusú anyagokat izolálják (a használt ligandum típusa zárójelben van feltüntetve):
- enzimatikus inhibitorok, szubsztrátok és kofaktorok (enzimek) analógjai;
- genetikai idegenség jeleit mutató bioorganikus anyagok, vírusok és sejtek (antitestek);
- nagy molekulatömegű szénhidrátok, monoszacharid polimerek, glikoproteinek (lektinek);
- nukleáris fehérjék, nukleotidil-transzferázok (nukleinsavak);
- receptorok, transzportfehérjék (vitaminok, hormonok);
- sejtmembránokkal (sejtekkel) kölcsönhatásba lépő fehérjék.
Ezt a technológiát immobilizált enzimek előállítására is használják, és ezeknek a cellulózhoz való kötődése lehetővé teszi immunszorbensek termelését.
DNS-kötő fehérjék kromatográfiája
A DNS-kötő fehérjék izolálása a következővel történik:heparin. Ez a glükózaminoglikán sokféle molekulát képes megkötni. Az ebbe a csoportba tartozó fehérjék affinitáskromatográfiáját olyan anyagok izolálására használják, mint:
- a transzláció beindításának és megnyúlásának tényezői (nukleinsavmolekulák és fehérjék szintézise);
- resztriktázok (enzimek, amelyek felismernek bizonyos szekvenciákat a kettős szálú DNS-ben);
- DNS-ligázok és polimerázok (olyan enzimek, amelyek katalizálják két molekula összekapcsolódását, hogy új kémiai kötést hozzanak létre, és részt vesznek a DNS-replikációban);
- szerin proteáz inhibitorok, amelyek fontos szerepet játszanak az immunrendszeri és gyulladásos folyamatokban;
- növekedési faktorok: fibroblaszt, Schwann, endoteliális;
- az extracelluláris mátrix fehérjéi;
- hormonreceptorok;
- lipoproteinek.
Méltóság
Ez a módszer az egyik legspecifikusabb reaktív vegyületek (enzimek és nagyobb aggregátumok – vírusok) izolálására. Azonban nem csak biológiailag aktív anyagok izolálására használják.
Antitestek kimutatása kis mennyiségben, poliadenilsav mennyiségi értékelése, dehidrogenázok molekulatömegének gyors meghatározása, egyes szennyező anyagok eltávolítása, a tripszin inaktív formájának aktiválódási kinetikájának, az ember molekulaszerkezetének vizsgálata interferonok – ez nem a teljes listája azoknak a vizsgálatoknak, amelyekben affinitást alkalmaznak.kromatográfia. A klinikán való használat az alábbi előnyeinek köszönhető:
- Hatékony tisztítási képességfehérjék, poliszacharidok, nukleinsavak. Fizikai és kémiai tulajdonságaikban kissé eltérnek, és elvesztik aktivitásukat a hidrolízis, denaturáció és más, más módszerekben alkalmazott kezelések során.
- Az anyagok szétválásának sebessége, a folyamat dinamikus jellege.
- Nincs szükség speciális enzimtisztításra és izoenzimes homogenizálásra a disszociációs állandók meghatározásához.
- Az anyagok széles skáláját képes elkülöníteni.
- Kevés ligandum-fogyasztás.
- Az anyagok nagy mennyiségben történő szétválasztásának lehetősége.
- A biológiai makromolekulák megkötésének reverzibilis folyamata.
Ez a technika másokkal kombinálható, hogy további mezőt (gravitációs, elektromágneses) hozzon létre. Ez lehetővé teszi a kromatográfia technikai lehetőségeinek bővítését.
Enzimtechnika
Ennek a módszernek köszönhetően megkezdődött a biotechnológia egy új ágának, az enzimtechnikának az aktív fejlesztése.
Az enzimizoláláshoz használt affinitáskromatográfia a következő előnyökkel rendelkezik:
- enzimek beszerzése nagy mennyiségben rövidebb idő miatt, ennek eredményeként - árcsökkenésük;
- az enzimek immobilizálása jelentősen kiterjesztheti alkalmazási körüket az orvostudományban és az iparban;
- Az enzimek oldhatatlan szilárd hordozóval való összekapcsolása lehetővé teszi a mikrokörnyezet hatásának és a reakciók irányának vizsgálatát, amelyek fontos szerepet játszanak a természetes és élettani folyamatokban.
