Az áramlási citometria egy citológiai kutatási módszer, amelyet a sejtek mélyreható elemzésére használnak. Előnye, hogy lehetővé teszi az egyes sejtek egyenkénti tanulmányozását. Ez a fajta elemzés segít néhány paraméter kiértékelésében több száz cellában másodpercek alatt. Ennek eredményeként a citofluorimetriát a tudósok és klinikusok számára jelenleg elérhető egyik leggyorsabb és legpontosabb elemzési módszernek tekintik.
Elvek
Az áramlási citometria elve a sejtek fényszórásának és lumineszcenciájának (fluoreszcenciájának) mérésén alapul. A sejtszuszpenziót nagy sebességgel áramlik át a citométer cellán, ahol lézerrel besugározzák. Ott végzik el az úgynevezett hidrodinamikus fókuszálást is. Mechanizmusa az, hogy a cellából kiáramló áramlás a vizsgált részecskékkel a kimeneten a külső sugárba áramlik, amelynek nagyobb a sebessége. Ennek eredményeként a részecskék rendezett láncban helyezkednek el.
Az elősejteket speciális fluoreszcens festékekkel (fluorokrómokkal) jelölik. Nekik köszönhetően a lézersugármásodlagos fényt gerjeszt. A vett fényjeleket detektorok regisztrálják. Ezt követően az információkat olyan szoftveralgoritmusok segítségével dolgozzák fel, amelyek lehetővé teszik az egyes feltételben eltérő sejtpopulációk megszámlálását.
A hagyományos mikroszkóppal végzett kutatás gyakran nem tesz különbséget a különböző sejtek között, mert ugyanúgy néznek ki. A citofluorimetria más adatokat szolgáltathat (DNS-szerkezet integritása), elemezheti a fehérje expresszióját, a sejtek túlélését.
Mivel a fluorokrómok gerjesztéséhez különböző hullámhosszú fénynyalábokra, valamint különböző típusú detektorokra van szükség, a modern berendezéseket számos érzékelési csatornával (4-től 30-ig) szerelik fel. A lézersugárzók száma 1 és 7 között lehet. A bonyolultabb eszközök lehetővé teszik a részecskék több tulajdonságának többparaméteres vizsgálatát egyszerre.
Előnyök és hátrányok
Az áramlási citometria előnyei a következők:
- nagy feldolgozási sebesség (akár 30 ezer esemény regisztrálása 1 másodperc alatt);
- lehetőség nagyszámú sejt tanulmányozására (akár 100 millió mintában);
- A fluoreszkáló fény intenzitásának számszerűsítése;
- az egyes cellák elemzése;
- heterogén folyamatok egyidejű vizsgálata;
- adatok automatikus szétválasztása sejtpopulációk szerint;
- az eredmények minőségi megjelenítése.
A technológia másik jellemzője azaz elemzett részecske több fluoreszcens oldattal megfesthető. Ennek köszönhetően többparaméteres vizsgálat történik.
A hátrányok közé tartozik a technikai felszereltség bonyolultsága és a speciális minta-előkészítés szükségessége.
Citométerek
Az első ilyen típusú készülékek már 1968-ban megjelentek Németországban, de jóval később terjedtek el. Jelenleg az áramlási citometria módszerével működő összes eszköz 2 típusra osztható:
- fluoreszcens sugárzást (két vagy több hullámhossz), 10°-os és 90°-os fényszórást mérő eszközök (kis szögű és oldalsó szórásérzékelő);
- eszközök, amelyek amellett, hogy több cellaparamétert mérnek, ezeknek a kritériumoknak megfelelően automatikusan csoportokba rendeződnek.
Az előretolt szórási detektort a sejt méretének meghatározására tervezték, az oldalsó szórási eszköz pedig lehetővé teszi az intracelluláris szemcsék jelenlétéről, a citoplazma és a sejtmag térfogatarányáról való információszerzést.
A klasszikus citométerek a fénymikroszkópokkal ellentétben nem teszik lehetővé a sejt képének elkészítését. Az utóbbi években azonban olyan kombinált eszközöket fejlesztettek ki, amelyek képesek kombinálni a mikroszkóp és a citofluoriméter képességeit. Az alábbiakban lesz szó róla.
Képalkotó citométerek
A klasszikus áramlási citometriában használt műszerek esetében,egy jellemző: ha ritka eseményeket regisztrálnak az elemzett sejtek populációjában, akkor nem lehet felmérni, mi a lényege. Ezek a részecskék lehetnek elh alt sejtek maradványai vagy ritka csoportjaik. A hagyományos eszközökben az ilyen adatok ki vannak zárva az események általános áramlásából, de éppen ezek lehetnek különösen értékesek a tudományos és klinikai elemzés szempontjából.
A képalkotó áramlási citométerek új generációja lehetővé teszi, hogy minden egyes sejtről képet készítsen, amely az áramlásban áthalad a detektorzónán. Könnyen megtekinthető, ha rákattint a diagram megfelelő területére, amely megjelenik a számítógép monitorán.
Alkalmazási területek
Az áramlási citometria egy univerzális módszer, amelyet az orvostudomány és a tudomány számos területén használnak:
- immunológia;
- onkológia;
- transzplantológia (vörös csontvelő, őssejtek átültetése);
- hematológia;
- toxikológia;
- biokémia (a sejten belüli savasság mérése, egyéb paraméterek vizsgálata);
- farmakológia (új gyógyszerek létrehozása);
- mikrobiológia;
- parazitológia és virológia;
- oceanológia (a fitoplankton tanulmányozása a víztestek állapotának felmérésére és egyéb feladatokra);
- nanotechnológia és mikrorészecske-elemzés.
Immunológia
Az emberi immunrendszer számos sejtből áll. Az áramlási citometria az immunológiában lehetővé teszi azok szerkezetének és funkcióinak értékelését, azaz morfofunkcionális vizsgálatok elvégzését.elemzés.
Az ilyen kutatások segítenek megérteni az immunitás összetett természetét. A sejtek fenotípusai megváltoznak az antigének általi aktiválás, a patológiák kialakulása és más tényezők hatására. A citofluorometria képes az immunsejtek szubpopulációinak összetett keverékben történő elkülönítésére, és az idők során bekövetkező összes változásuk értékelésére.
Onkológia
Az onkológiában az egyik legfontosabb feladat a sejtek típus szerinti differenciálása. Az áramlási citometriás elemzés elve az onkohematológiában a következő jelenségen alapul: ha egy mintát speciális fluoreszcens festékkel kezelünk, az a citoplazmatikus fehérjékhez kötődik. Az aktívan szaporodó sejtekben történő osztódás után tartalma felére csökken. Ennek megfelelően a sejtlumineszcencia intenzitása kétszeresére csökken.
Más módszerek is vannak a burjánzó sejtek kimutatására:
- DNS-kötő festékek (propidium-jodid) használata;
- jelölt uracil használata;
- a ciklin fehérjék fokozott expressziójának regisztrálása, amelyek részt vesznek a sejtciklus szabályozásában.
